ФИТОБИОТИКИ КАК АЛЬТЕРНАТИВА АНТИБИОТИКАМ

Статья опубликована в журнале “Белорусское сельское хозяйство”, №6 (230) июнь 2021. © Все права защищены.

Начальник консультационного отдела ООО "Биоком”,
ДМИТРИЙ ВОЛОШИН
Старший преподаватель кафедры микробиологии и эпизоотологии УО “Гродненский государственный аграрный университет”,
специалист по работе с клиентами ООО “Биоком”,
ВИКТОР ДУБИНИЧ

Целенаправленное промышленное получение и широкое использовав антибиотиков в клинической практике не превышает еще и ста лет, но с проблемой антибиотикорезистентности медицинское сообщество столкнулось едва ли не в первое десятилетие с момента массового применения антибактериальных препаратов. Их широкое и часто бесконтрольное использование привело к тому, что патогенные микроорганизмы оказались устойчивы к антибиотикам. Почему возникает антибиотикорезистентность? Чем можно заменить антибиотики в ветеринарии?

По данным The Review on Antimicrobial Resistance, в странах с развитым медицинским обслуживанием (Европа и Северная Америка) в результате антибиотикорезистентности ежегодно умирают около 50000 человек, а всего в мире — около 700 000. Ожидается, что, если не принять меры, к 2050 году около 10 млн человек будут ежегодно умирать (J.O. Neil, Report on Antimicrobial Resistance, 2016) от возбудителей инфекций, устойчивых к антибиотикам.

Человек применяет антибиотики давно. Так, еще более 2000 лет назад в Китае, Греции, Египте открытые раны лечили припарками из заплесневелого хлеба. Но бурное развитие этой сферы началось только после массового применения пенициллина, свойства которого открыл А. Флеминг в 1928 году. После того как в 1940 году была получена пригодная для производства стабильная форма, два десятилетия длился “золотой век” поиска и производства антибиотиков.

С ростом объема производства и открытием новых классов антибиотиков они стали общедоступны и начали использоваться не только в медицине, но и в сельском хозяйстве. Бесконтрольное применение привело к ожидаемому результату — массовому появлению резистентности, причем как среди патогенных, так и условно патогенных микроорганизмов окружающей среды.

Антибиотикорезистентность, как и антибиотические соединения, продуцируемые микроорганизмами, — один из древних способов распространения и выживания микроорганизмов с момента их появления на Земле, а это ни много ни мало около 3,5 млрд лет. О древности данных свойств микроорганизмов говорят результаты исследований реконструированных комплексных кластеров с выявлением устойчивости к ванкомицину. Он был открыт в 1954 году, в клинической практике применяется с 1958 года (Hutchings et al., 2019) из ДНК, полученной из 30000-летней вечной мерзлоты Берингии (Waglechner& Wright, 2017).

В целом механизм действия антибиотиков на микроорганизмы основан на результате одного или нескольких комплексных воздействий на микробную клетку и сопровождается нарушением синтеза клеточной стенки, нуклеиновых кислот, белка, пуринов и пиримидинов, нарушением функции мембранных структур и ингибированием работы дыхательных ферментов. Но бактерии в ответ на деструктивное внешнее воздействие реагируют изменениями, связанными со структурой, которая является мишенью для антибиотика.

Один из самых простых методов приспособления для микроорганизмов — изменение, препятствующее связыванию с молекулой антибиотика в белке или гене клетки. Наличие или же продукция ферментов, нарушающих. фиксацию молекулы антибактериального препарата со структурой-мишенью, является более сложным процессом. Развитие таких свойств считается приобретением функциональной особенности.

У ряда микроорганизмов есть способы снижения ной концентрации антибиотика в клетке, основанные на полном разрушении молекулы антибиотика ферментами или изменении ее в химическом отношении так, что она становится неактивна. Известен и способ уменьшения внутриклеточной концентрации антибактериальных препаратов из-за активного их выделения с продуктами метаболизма за пределы клеточной стенки. Структурные особенности клеточной стенки также могут служить результатом изменений, связанных с формированием эволюционной резистентности. В результате внутриклеточная концентрация антибиотика не достигает нужного значения для нарушения или ингибирования внутриклеточных процессов (Martin, Casqueiro & Liras, 2005; Piddock, 2006; Abdelwahab et al., 2016).

“Микробные города”

Один из факторов, сильно снижающих эффективность применения антибиотиков, — способность микроорганизмов формировать биопленки. В современном представлении почти все микроорганизмы в естественной среде существуют в виде биопленок, а отдельные свободноживущие рассматриваются как формы, способствующие расселению. Биопленки — своеобразные ‘полимикробные города”, представленные не просто генетически неоднородными микроорганизмами, а существами, обладающими определенной специализацией. Общее количество микробов от всего объема биопленки колеблется в пределах 5-35 %.

Как биопленки способствуют формированию антибиотикорезистентности? Дело в том, что введенный антибактериальный препарат в эффективной концентрации, сталкиваясь с биопленкой, начинает терять активность уже при взаимодействии с поверхностной мембраной, которая мешает проникновению вглубь и может вызывать инактивацию некоторых молекул. Часть препарата, проникнув в матрикс, теряет эффективность под воздействием веществ, продуцируемых антибиотикорезистентными штаммами. Более того, в биопленке происходит уменьшение свободной поверхности клеточной стенки бактерий, способной взаимодействовать с антибиотиком. Кроме того, из-за клеток-персистеров — неметаболизирующих бактерий, либо обладающих низким уровнем метаболизма, которые окружены даже в стабильном состоянии экзополисахаридным матриксом, — часть патогенов становится почти не чувствительна к антибиотикам.

Новые устойчивые штаммы

Человеческая деятельность приводит не просто к появлению новых устойчивых видов и штаммов микроорганизмов, но и является одним из основных векторов их распространения. Так, увеличение поголовья и высокая концентрация животных на единице площади приводили к тяжелым экономическим последствиям в случае возникновения инфекционных заболеваний. Выход был найден, и в конце 50-х годов ХХ века в США начали использовать кормовые антибиотики. Этот опыт переняли в Европе и СССР. В результате произошло снижение заболеваемости и падежа среди животных, увеличился прирост живой массы.

Но уже спустя 30 лет выяснилось, что кормовые антибиотики — одна из причин появления новых устойчивых штаммов, что в конечном итоге привело к увеличению смертности людей от инфекционных патологий.

Второй фактор, усугубляющий положение дел, — применение антибактериальных препаратов с нарушением правил антибиотикотерапии. Не стоит сбрасывать со счетов и глобализацию многих процессов, которая затронула сельское хозяйство, производство продуктов питания, торговлю племенными животными и животным сырьем.

Сегодня уже никто не удивляется говядине из Латинской Америки, фруктам из Африки, продуктам аквакультуры из стран Юго-Восточной Азии. В итоге вместе с продукцией АПК перемещаются не только различные виды бактерий, грибов — происходит распространение генов антибиотикорезистентности.

На извечный вопрос “что делать?” однозначного ответа никто дать не может, поскольку в сферу производства продуктов питания вовлечены многие сферы экономики, а государства обеспечивают свою продовольственную безопасность.

И все же страны ЕС начали борьбу с формированием антибиотикорезистентности микроорганизмами и ее распространением. Еще в 1998 году Европа отказалась от применения бацитроцина, спирамицина, виргиниамицина и тилазина. С 1 января 2006 года на территории стран ЕС запрещены к применению кормовые антибиотики.

Таким образом, произошло резкое сокращение объемов их применения фермерами.

Антибиотики — под контролем

Следующий важный момент — проведение антибиотикотерапии животных только под контролем ветврача, с обязательной постановкой диагноза, подтвержденного лабораторными исследованиями, содержащими информацию о возбудителе с определением его устойчивости. Но на практике это возможно только в случае заболеваний, которые не грозят гибелью животного в ближайшем будущем.

Дело в том, что сегодня отсутствуют экспресс-тесты на деление резистентности микроорганизмов, а микробиологические исследования требуют времени. В итоге назначение антибактериальных препаратов происходит эмпирически, на основании собственных наблюдений и знания эпизоотологической ситуации ветеринарным врачом, что зачастую не приводит к желаемому эффекту.

Поэтому для уменьшения количества применяемых антибактериальных препаратов и кормовых антибиотиков, наряду с улучшением кормления и содержания, следует более широко вводить в практику применение альтернативных препаратов и кормовых добавок, направленных в первую очередь на профилактику заболеваний.

Фитобиотики

Одной из таких альтернативных групп являются фитобиотики. Это разнородные органические соединения растительного происхождения, вторичные продукты метаболизма. Общее количество идентифицированных веществ, обладающих достаточной биологической активностью, превышает 100 тыс. соединений, большинство которых разделены по химической структуре на восемь основных групп. Например, фенолы (карвакрол, тимол, эвгенол), альдегиды (циннамальдегид), спирты (ментол, нерол, цитронелол), алкалоиды (капсаицин) и др. (Подобед, 2018).

Источник фитобиотиков — такие культуры, как маклея сердцевидная, розмарин, орегано (душица), тимьян (чабрец), чеснок, юкка, артишок, кориандр, гвоздика, корица, шалфей, облепиха, базилик, лук, мексиканский стручковый перец и многие другие. Следует отметить, что даже среди одного вида растений содержание фитобиотиков может значительно различаться. Это зависит от погодных условий климатической зоны произрастания, от части растения, из которого были получены вторичные метаболиты, а также от времени сбора частей растения. По данным Radusiene (2005), общее содержание эфирных масел в душице, выращенной в ботаническом саду Литвы, было значительно ниже, чем в растениях, произраставших в Греции. Более того, в работе Kokkini (1996) установлено, что даже в разных регионах Греции соотношение тимола и карвакрола в душице сильно отличается вследствие разницы окружающей температуры, относительной влажности воздуха, инсоляции. Таким образом, одно и то же растение обладает высокой вариабельностью компонентов, а словосочетание “масло тимьяна” (или другого растения — розмарина, орегано, чабреца и др.) не содержит полноценной информации о составе активных компонентов, а также их количестве и процентном соотношении. Это объясняет тот факт, что в гуманитарной медицине применение растительных компонентов не имеет на сегодняшний день широкого распространения, ведь для решения данной проблемы необходима “разложенная по полочкам” структура всех составляющих компонентов вторичных метаболитов растений, определение не только спектра патологий, но и вводимых дозировок.

Ценность фитобиотиков как одной из составных частей рационов для сельскохозяйственных животных и птиц заключается в их разнонаправленном действии на организм животных — иммуномодулирующем, противовоспалительном, антиоксидантном. Они способны нормализовать работу ферментных систем кишечника, а благодаря наличию эфирных масел придают приятный аромат кормосмеси, увеличивая тем самым поедаемость кормов, что в свою очередь приводит к лучшему усвоению питательных веществ рациона и повышению продуктивности животных.

Однако наиболее важное свойство фитобиотиков — их влияние на микроорганизмы. На сегодняшний день выявлено антибактериальное, противогрибковое и противовирусное действие вторичных метаболитов растений, хотя в сельском хозяйстве основное внимание уделяется бактерицидному и бактериостатическому эффекту фитобиотиков (Ульрих & Латышева, 2018). Особо значимыми в разработке данного направления являются эфирные масла.

Хотя изучение свойств фитобиотиков началось более ста лет назад, механизм действия многих компонентов до конца не выяснен. Согласно данным B.C. Крюкова и И.В. Глебовой, большинство исследователей склоняются к мысли, что основное воздействие фитобиотиков направлено на повреждение клеточной стенки и цитоплазматической мембраны бактерий.

С другой стороны, следует учитывать и тот факт, что данная структура более доступна для исследований, чем внутриклеточные компоненты (Крюков & Глебова, 2017). Тем не менее выявлены вторичные метаболиты растений, способные приводить к ингибированию работы эффлюкс-систем клеток (с их помощью происходит удаление токсичных для клетки компонентов за ее пределы), нарушать синтез нуклеиновых кислот, приводить к коагуляции участков цитоплазмы и угнетать метаболизм клетки путем инактивации ферментов бактерий (Буданова, Горленко & Киселев, 2019).

Вторичные метаболиты растений

Ряд фитобиотиков обладает либо весьма узким спектром активности лишь в отношении грамположительных микроорганизмов, либо оказываемое ими ингибирующее действие одинаково как для грамотрицательных, так и для грамположительных бактерий. Подобное разделение обусловлено различным строением клеточной стенки бактерий. Так, пептидогликановый слой не является достаточно серьезной преградой для вторичных метаболитов растений, которые после проникновения в бактериальную клетку приводят к разрушению компонентов цитоплазматической мембраны и снижению синтеза белков клеточной стенки.

В случае с грамотрицательными микроорганизмами ряд особенностей в структуре клеточной стенки обеспечивает более высокую устойчивость, в том числе и к антибактериальным препаратам. Тем не менее основной механизм воздействия вторичных метаболитов растений — связывание их с фосфолипидами наружной мембраны. В результате изменяется ее проницаемость, что влечет развитие осмотического шока и последующую гибель бактериальной клетки.

Подобный механизм наблюдается и при воздействии активных компонентов фитобиотиков на цитоплазматическую мембрану. В результате проведенных экспериментов выявлено, что данное воздействие наблюдается при применении карвакрола или тимола в отношении Staphylococcus aureus, а пептид моринги масличной — Pseudomonas aeruginosa и Salmonella typhimurium (Буданова et al, 2019).

Исходя из исследований Resunova et at., наиболее активны в подавлении роста бактерий независимо от строения клеточной стенки — коричник цейлонский, лимонный сорго и душица обыкновенная (Rusenova & Parvanov, 2009).

Еще один фактор воздействия на микробную клетку фенольных и полифенольных соединений вторичных метаболитов — блокировка группы ферментов бета-лактамаз, накапливающихся в периплазматическом пространстве. Они обусловливают антибиотикорезистентность грамотрицатель ных бактерий в отношении бета-лактамных антибиотиков.

Механизм действия терпенов на бактерии заключается в нарушении работы эффлюкс-системы путем закупорки белкового канала либо при нарушении транспорта ионов водорода непосредственно к эффлюкс-насосам. Самый яркий пример подобного нарушения жизнедеятельности клетки — применение тотарола в отношении Staphylococcus aureus. Прекращение выделения токсичных для бактерии метаболитов приводит к накоплению их в цитоплазме, что вызывает гибель клетки. Так, диссациация полифенольных соединений вторичных метаболитов растений происходит с образованием катионов водорода. Это вызывает нарушение перехода электронов от одного комплекса к другому. В итоге происходит нарушение синтеза АТФ в органеллах бактериальной клетки, что приводит к ее гибели от недостатка энергии.

Воздействие же фитобиотиков на нуклеиновые кислоты возможно двумя путями:

• нарушение синтеза нуклеиновых кислот при взаимодействии аллицина (основного компонента измельченного чеснока) с ферментами, когда происходит уменьшение их активности и скорость матричного синтеза снижается;

• некоторые алкалоиды, например берберин, образуют комплексы с ДНК, нарушая процесс репликации, а некоторые флавоноиды (робинетин, мирицетин, эпигаллотецин) оказывают двойственный эффект, ингибируя как репликацию, так и транскрипцию ДНК бактериальной клетки (Буданова et al, 2019).

В последнее время появились результаты исследований о том, что такие вторичные метаболиты, как тимол и карвакрол, не только оказывают бактериостатическое бактерицидное действие, но и замедляют процесс развития антибиотикорезистентности патогенных штаммов Е. соli, а также способствуют снижению численности паразитических кокцидий в кишечнике телят. То есть применение фитобиотиков способно снизить число используемых антибактериальных препаратов, уменьшить риск развития антибиотикорезистентности микроорганизмами. Возможен возврат сырья животного происхождения в случае обнаружения остаточных количеств антибиотиков.